Tikslieji ir gamtos mokslai / Chemija

Plazmidinės DNR optimalių karpymo sąlygų parinkimas naudojant skirtingas restrikcijos endonukleazes

0 atsiliepimų
Autorius:

Per paskutinius 40 metų molekulinėje genetikoje ir genų inţinerijoje naudojamos rekombinantinės DNR technologijos paradė neįtikėtiną šuolį. Toks staigus technologijų vystymasis ir tobulėjimas siejamas su restrikcijos ekdonukleazių atradimu (Hyde, 2009). Dar kitaip vadinamų – „biologinėmis ţirklėmis“, kurios kerpa DNR sritis tam tikrose specifinėse vietose išlaikydamos gautus DNR fragmentus gyvybingus ir tinkamus tolesniam jų naudojimui. Tiksliam ir greitam restrikcijos endonukleazių veikimui reikalingos optimalios sąlygos, kurios parenkamos, atsiţvelgiant į kiekvienos jų savybes. Nuo tokių reakcijos sąlygų priklauso gaunamų rezultatų kokybė.

 

„Thermo Fisher Scientific“ yra viena didţiausių pasaulio bendrovių, siūlančių produktus ir paslaugas mokslui. Darbuotojų skaičius šiuo metu viršija 50 tūkst. 50 šalių padaliniuose ir kasmet auga, o metinės pajamos siekia 17 mlrd. JAV dolerių. Šiuo metu „Thermo Fisher Scientific Baltics“ dirba virš 600 ţmonių ir per pastaruosius 2015 metus įmonės pajamos siekė 102 mln. eurų, tai yra 25 % daugiau nei 2014 metais. Kalbant tik apie pačių reagentų pardavimą, jie sudaro net 70 % visų gautų pajamų.

 

„Fermentas“ - dalimi šios bendrovės (dabar - „Thermo Fisher Scientific Baltics“) tapo remiantis 2010 m. geguţės 27 d. pirkimo sutartimi. „Fermentas“ vienas pirmųjų iš molekulinės biologijos produktų gamintojų ne tik Lietuvoje, bet ir visame pasaulyje įsidiegė kokybės valdymo sistemą pagal ISO 9002 standartą 1996 m.

 

Įmonės siūlomą produkciją naudoja farmacijos ir biotechnologijos įmonės, ligoninių ir klinikų diagnostikos laboratorijos, universitetai, mokslo institutai bei valstybinės agentūros, aplinkos ir procesų kontrolės institucijos visame pasaulyje, kurių kaip ir bendrovės tikslas – kurti ir puoselėti švaresnį, saugesnį bei sveikesnį pasaulį.

 

Temos aktualumas. Tyrimo metu buvo siekiama nustatyti optimalias plazmidinės DNR pUC19 karpymo sąlygas (restrikcijos buferinį tirpalą, restrikcijos endonukleazės kiekį bei inkubacijos laiką) naudojant skirtingas restrikcijos endonukleazes ir jų mišinį. Tai svarbus eksperimentas, nes pasirinktas metodas naudojamas DNR fragmento gamybos technologiniame procese. Eksperimentas su pasirinktomis restrikcijos endonukleazėmis atliktas dėl to, kad šios restrikcijos endonukleazės ateityje galėtų būti naudojamos DNR fragmentų gamyboje.

 

Tyrimo problema. Optimalių plazmidinės DNR karpymo sąlygų parinkimas naudojant skirtingas restrikcijos endonukleazes.

 

Tyrimo tikslas: Įvertinti optimalias plazmidinės DNR karpymo sąlygas naudojant skirtingas restrikcijos endonukleazes ir jų mišinius.

 

 

16

Tyrimo uţdaviniai:

 

  1. Išanalizuoti literatūrą apie plazmidines DNR, restrikcijos endonukleazes, restrikcijos reakcijos atlikimo metodiką, spektrofotometrinį nukleorūgščių koncentracijos nustatymo ir elektroforetinį reakcijos efektyvumo įvertinimo metodus, surinkti informaciją apie eksperimentui naudojamą įrangą

 

  1. Nustatyti plazmidinės DNR koncentraciją spektrofotometriškai, sukarpyti plazmidinę DNR pavienėmis restrikcijos endonukleazėmis ir naudojant jų mišinį, elektroforetiškai patikrinti reakcijos efektyvumą ir įvertinti optimalias restrikcijos reakcijos sąlygas

 

  1. Išnagrinėti nukleino rūgščių standartų gamybos padalinyje saugaus darbo ir aplinkosaugos reikalavimų vykdymą;

 

  1. Apskaičiuoti plazmidinės DNR spektrofotometrinio koncentracijos nustatymo, restrikcijos reakcijos ir elektroforetinio reakcijos efektyvumo įvertinimo tyrimų išlaidas, schematizuoti jų struktūrą.

 

Tyrimo objektas ir tyrimo dalykas. Plazmidinės DNR pUC19 hidrolizė pavienėmis restrikcijos endonukleazėmis ir jų mišiniu.

 

Tyrimo metodai: literatūros ir informacijos šaltinių analizė, spektrofotometrinis koncentracijos nustatymo, restrikcijos reakcija, elektroforetinis restrikcijos reakcijos efektyvumo

 

įvertinimas.

Darbo tipas:
Dalykas:
Apimtis:
14000 žodžiai (-ų)
Lygis:
Universitetas
Atsisiųsti

Turinys

  • 1.
  • TEORINĖ DALIS
  • 20
  • 1.1.
  • Nukleorūgštys
  • 20
  • 1.1.1. Nukleorūgščių struktūra ir funkcijos
  • 20
  • 1.2.
  • Plazmidinė DNR
  • 22
  • 1.2.1. Plazmidinės DNR sandara ir funkcijos
  • 22
  • 1.2.2.
  • Plazmidinė DNR pUC19
  • 22
  • 1.3.
  • Restrikcijos endonuklezės
  • 24
  • 1.3.1.
  • Restrikcijos endonukleazių klasifikacija
  • 25
  • 1.3.2.
  • Restriktazė HindIII
  • 25
  • 1.3.3.
  • Restriktazė BglI
  • 27
  • 1.3.4.
  • Restriktazė HinfI
  • 27
  • 1.3.5. Restrikcijos endonukleazių veikimo sąlygos
  • 28
  • 1.4. Kiekybinis spektrofotometrinis produkto įvertinimas
  • 30
  • 1.4.1.
  • Metodo principas
  • 30
  • 1.4.2. Naudojama įranga, priemonės ir reagentai
  • 31
  • 1.5. Kokybinis elektroforetinis produkto įvertinimas
  • 32
  • 1.5.1.
  • Metodo principas
  • 32
  • 1.5.2. Agaroziniai geliai, jų paruošimas
  • 33
  • 1.5.3. Gautų duomenų dokumentavimas ir įvertinimas
  • 34
  • 1.6.
  • Teorinės dalies išvados
  • 37
  • 2.
  • EKSPERIMENTINĖ DALIS
  • 38
  • 2.1.
  • Spektrofotometrinis kiekybinis plazmidinės DNR pUC19 įvertinimas
  • 38
  • 2.2. Plazmidinės DNR karpymas restrikcijos endonukleazėmis ir elektroforetinis reakcijos
  • efektyvumo patikrinimas40
  • 2.2.1. Restrikcijos reakcijos įranga, priemonės ir reagentai40
  • 2.2.2. Restrikcijos reakcijos komponentų pasirinkimas ir tūrių apskaičiavimas41
  • 2.2.3. Restrikcijos reakcijos eiga44
  • 2.2.4. Restrikcijos reakcijos elektroforetinis įvertinimas46
  • 2.2.4.1. Restrikcijos reakcija su HindIII restriktaze46
  • 2.2.4.2. Restrikcijos reakcija su BglI restriktaze48
  • 2.2.4.3. Restrikcijos reakcija su HindIII ir BglI restriktazėmis50
  • 2.2.4.4. Restrikcijos reakcija su HinfI restriktaze51